近期，清华大学药学院刘刚教授课题组在美国化学会杂志Analytical Chemistry发表了新型结核分枝杆菌单细胞荧光诊断试剂的研究结果，题目：From Bench to Clinic: A Nitroreductase Rv3368c-Responsive Cyanine-Based Probe for the Specific Detection of Live Mycobacterium Tuberculosis，已于2024年1月8日上线（https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04293）。该项研究由洪小巧博士生、耿鹏飞博士生和北京胸科医院田娜博士生等共同完成，并得到了首都医科大学北京胸科医院孙照刚博士的支持。
结核病是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) 引起的传染病，其特点是死亡率高，低诊断率。根据世界卫生组织的统计，2021年，全球预计有1060万人患上结核病，但仅有640万人被确诊为结核病，结核病的诊断是结核防疫中最薄弱的一环。使用auramine O (AO) 或Ziehl-Nielsen痰涂片镜检是结核高负担国家的一线诊断方法，然而，AO和Ziehl-Nielsen都与Mtb细胞壁中的分枝菌酸结合，不能区分活菌和死菌，不能反映结核病患者服药后的治疗效果，容易导致耐药菌的产生。此外，AO的染色步骤繁琐，易受临床样本中的食物残渣、杂蛋白等自发荧光干扰、抗淬灭能力差，临床迫切需要开发新一代光稳定性强的荧光探针，用于快速、简便地标记Mtb。由于临床痰液样本中存在不同的菌种和复杂的成分，对荧光探针的化学结构稳定性、光学稳定性、特异性以及样本处理稳定性等多方面均有较高的要求，虽然目前已报道了多种Mtb新型荧光探针，但多停留在实验室水平。
本研究设计合成了一系列的花菁类荧光探针，并确定荧光强度最高的Cy3-NO2-tre为最终荧光试剂。Cy3-NO2-tre自身不发光，但在细菌内可被特异的硝基还原酶Rv3368c还原后开启荧光。Cy3-NO2-tre可以选择性标记不同种属混合菌中的Mtb，而不会对其他的细菌产生荧光标记 (图1)。课题组采用Pull down 实验技术鉴定了Cy3-NO2-tre作用靶点—Rv3368c，并通过比较Cy3-NO2-tre在Rv3368c基因敲除、回补分枝杆菌菌株内、过表达Rv3368c大肠杆菌DE3的荧光强度得到验证 (图2)。基于NCBI的生物信息学分析结果表明，Rv3368c主要表达于结核分枝杆菌科。
图1.花菁荧光探针的结构与荧光标记能力。
图2. 特异性硝基还原酶RV3368c的探究与验证。
Cy3-NO2-tre可以选择性标记宿主细胞内的Mtb，而不会对宿主细胞产生非特异性标记 (图3)。Cy3-NO2-tre响应较快、免清洗和灵敏度高的优点使其能够实时检测Mtb感染宿主细胞的全过程。课题组利用Cy3-NO2-tre成功地观察到宿主细胞伸出伪足捕获Mtb的过程，同时也发现某些细菌能够成功逃脱宿主细胞伪足的“抓捕”，为进一步研究宿主细胞和Mtb的相互作用提供了工具分子。
图3. Cy3-NO2-tre跟踪Mtb与宿主细胞的相互作用
课题组采用Cy3-NO2-tre检测了临床痰液样本中的活Mtb。与AO相比，Cy3-NO2-tre表现出显著更强的荧光抗淬灭能力 (图4)。基于Cy3-NO2-tre只标记活菌的特性，课题组将其与AO联用，初步研究了监测结核患者的抗结核药物的治疗效果。通常，结核患者需要服药三个月后再通过CT复查判断该患者对治疗方案的敏感性。采用Cy3-NO2-tre监测患者药物治疗前与治疗一周后痰液中活/死菌比例的变化，初步研究了患者服药治疗3个月后的CT结果相关性(图5)，表明Cy3-NO2-tre有可能能够用于早期监测抗结核药物的治疗效果，大规模的临床样本研究正在进行中。
图4. Cy3-NO2-tre在临床痰液样本上的荧光抗淬灭效果强于AO。
图5. Cy3-NO2-tre用于早期评价结核病患者的抗结核治疗效果。
