1） 液液相分离 (liquid-liquid phase separation, LLPS)是生物大分子在真核细胞中聚集形成无膜细胞器的基础，也是细胞区域化的重要机制，展现了真核细胞对各种生理活动的精准、动态的时空调控。当前，如何建立相分离现象和生物学功能之间的关系是该领域内的重要科学问题。相分离对系统计量高度依赖，各组分形成分相的临界浓度尤为关键，因此需要高效、快速、动态的扰动技术的支持。此外，如何避免体外实验中出现假阳性的可能、探究生理条件下的相分离状态、剖析分相液滴中支架蛋白与乘客蛋白身份和功能的转换及其内在分子机制等问题都迫切需要新技术和新方法的建立。现有技术手段如CRISPR-Cas9/RNA干扰（RNAi）等遗传学工具在体内直接研究相分离面临很多挑战，如相分离领域仍然缺乏在野生型细胞系上直接干扰LLPS的高效方法。在该工作中，本课题组建立了“PROTAC-target protein-LLPS”的研究方法，以期从多维度探究LLPS相关的内源蛋白-蛋白相互作用、蛋白时空动态调控的精密机制。在LLPS研究中，基于PROTAC的研究方法快速、高效、可逆，优于传统遗传学工具对靶基因的扰动；同时，相较于常用解聚凝聚体的小分子（如1,6-己二醇），PROTAC也更具有特异性和靶向性。另外，将此方法与多组学手段联合分析，不仅能够探究凝聚物中各组分之间的互作和功能伴随，而且将为相分离与生物功能之间建立因果关系提供可能。这是PROTAC在LLPS研究中的首次运用，为解决领域内关键问题提供了新方法和新见解。（ 代表性工作：Cell Discovery, 2023, 9, DOI: 10.1038/s41421-023-00544-0.)。

图一 BRD4-PROTACs工作模型示意图

2） 开发双靶双机制小分子降解剂。靶向蛋白降解是以泛素-蛋白酶体系统为基础，用小分子降解剂诱导靶蛋白降解的一种技术，其中最主要的两种降解机制包括PROTAC和分子胶。PROTAC分子由三部分组成，PROTAC分子可将靶蛋白锚定到E3泛素连接酶进而诱导其泛素化降解。与PROTAC类似，分子胶是单一的小分子片段，分子量较小，它通过诱导靶蛋白与E3泛素连接酶之间形成较为紧密的蛋白-蛋白相互作用来实现泛素化降解。这两种蛋白降解技术各有优缺点，例如PROTAC适于理性设计，但由于分子量偏大，导致成药性不足。分子胶分子量小，成药性好，且能降解难成药靶点，可以弥补PROTAC的不足，但由于需要在两个蛋白之间诱导形成一个结合口袋，设计难度大。如何平衡二者的优劣之处使靶向降解技术得到进一步发展是一个重要的问题。为打破现有技术的桎梏，本课题组在此工作中首次提出了将PROTAC分子与分子胶相融合的概念。根据PROTAC和分子胶的特点设计合成了一系列双靶、双机制的降解剂，这类新型降解剂既保留了降解BTK的PROTAC活性，又兼具降解GSPT1的分子胶特点，以PROTAC的思路设计合成双机制降解剂解决了分子胶设计难度大的问题，而作为分子胶降解GSPT1也补充了PROTAC在生物活性上的不足，对难治性肿瘤的临床治疗具有潜在重要意义。该双机制降解剂开发也为靶向降解技术的发展开拓了新的思路。（ 代表性工作：Cell Research, 2021, 25, 1315-1318. DOI: 10.1038/s41422-021-00533-6.)。

图二 发展双靶双机制小分子降解剂

3） 靶向CDK2诱导AML分化的PROTAC小分子探针研究。AML是一种常见的血液癌症，该病以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征。该疾病以蒽环类和胞苷药物联合化疗为主要临床治疗方案。该治疗方案一定程度上是有效的，但也存在严重的毒副作用，5年复发率高达70%。近期研究表明CDK2是一个潜在的分化治疗靶点。但是，由于CDK蛋白的高度同源性及ATP结合口袋的相似性，传统小分子抑制剂难以实现高选择性。传统激酶抑制剂通过多靶点协同抑制发挥功能，存在严重毒性，临床治疗和科研中尚无CDK2选择性的抑制剂。本课题组通过构建新型小分子靶向CDK2蛋白高效降解剂，从分化治疗角度为急性髓系白血病（AML）治疗提供了一种可能的治疗手段。代表性的CDK2蛋白降解剂CPS2可以在多种AML细胞系中以小于10 nM的DC₅₀高效选择性降解CDK2蛋白。区别于传统小分子抑制剂，CPS2可显著抑制细胞增殖，且不会引起显著的细胞凋亡。该分子在体内外实验中均体现出了良好的安全性，且对HSCs的生存无显著性影响。更为重要的是，代表性化合物CPS2可引起AML细胞的分化，该分化指标可通过细胞形态、细胞染色和表面标记物等多个维度进行监测，这为AML的治疗提供一种新的分化治疗的先导化合物。该工作基于蛋白质降解技术解决了长期以来的靶向CDK2的选择性难题，提供了一种可行的AML分化治疗先导化合物。除AML治疗外，该类降解剂或可在CDK2相关的其它疾病治疗领域也发挥重要功能。（ 代表性工作：Nature Chemical Biology, 2021, 16, 567-575. DOI: 10.1038/s41589-021-00742-5.）。

图三 CDK2选择性降解剂诱导AML细胞实现分化

4）开发小分子蛋白质靶向降解技术（PROTACs）克服Ibrutinib耐药的B细胞恶性肿瘤。非霍奇金淋巴瘤（NHL）是B细胞恶性肿瘤的一种， 2015年引起全球约23万人死亡，仅美国每年新增病例6万余人。自从2013年被FDA批准，BTK共价抑制剂Ibrutinib一直是治疗多种非霍奇金淋巴瘤的一线用药，包括套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、华氏巨球蛋白血症。尽管如此，根据最新的临床数据报道，针对Ibrutinib已经出现了严重的耐药性。由于BTK蛋白481位半胱氨酸突变为丝氨酸（C481S），使得Ibrutinib的活性下降近500倍，临床数据已经证明这一突变是病人产生对Ibrutinib耐药的根本原因。本课题组通过构建新型小分子靶向蛋白降解剂，招募E3泛素化连接酶靶向降解BTK蛋白。新构建的BTK蛋白降解剂可以在多种B细胞恶性肿瘤中高效降解BTK蛋白。小分子蛋白降解剂对BTK依赖的野生型人B细胞淋巴瘤（HBL-1）细胞的抑制活性与临床一线用药Ibrutinib相当。更为重要的是，新策略可以靶向降解C481S突变的BTK蛋白，克服B细胞恶性肿瘤BTK激酶由于C481S突变引起的对临床一线药物Ibrutinib的耐药性（图一）。该工作为基于蛋白质降解技术进行抗耐药B细胞恶性肿瘤的药物研发提供了重要信息。（ 代表性工作：Cell Research,2018, 22. 779–781； Leukemia, 2019, 33, DOI: 10.1038/s41375-019-0440-x.)。

图四 开发蛋白质靶向降解技术（PROTACs）克服Ibrutinib耐药的B细胞恶性肿瘤

1. Y. Shi, Y. Liao, Q. Liu, Z. Ni, Z. Zhang, M. Shi, P. Li*, H. Li*, Y. Rao*, ‘BRD4-targeting PROTAC as a unique tool to study biomolecular condensates’, Cell Discovery, 2023, 9, DOI: 10.1038/s41421-023-00544-0.

2. Z. Yang, Y. Sun, Z. Ni, C. Yang, Y. Tong, Y. Liu, H. Li and Y. Rao*, 'Merging PROTAC and molecular glue for degrading BTK and GSPT1 proteins concurrently', Cell Research, 2021, 25, 1315-1318. DOI: 10.1038/s41422-021-00533-6.

3. L. Wang, X. Shao, T. Zhong, Y. Wu, A. Xu, X. Sun, H. Gao, Y. Liu, T. Lan, Y. Tong, X. Tao, W. Du, W. Wang, Y. Chen, T. Li, X. Meng, H. Deng, B. Yang, Q. He, M. Ying*, Y. Rao*, 'Discovery of a first-in-class CDK2 selective degrader for AML differentiation therapy', Nature Chemical Biology, 2021, 16, Accepted. DOI: 10.1038/s41589-021-00742-5.

4. Y. Yang, H. Gao, X. Sun, Y. Sun, Y. Qiu, Q. Weng*, Y. Rao*, ‘A Global PROTAC Toolbox for Degrading BCR-ABL Overcomes Drug-Resistant Mutants and Adverse Effects’, Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63, accepted. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c00967.

5. M. Li, Y. Yang, Q. Zhao, Y. Wu, L. Song, H. Yang, M. He, H. Gao, B. Song, J. Luo*, Y. Rao*, ‘Degradation Versus Inhibition: Development of Proteolysis-Targeting Chimeras for Overcoming Statin-Induced Compensatory Upregulation of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase’. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63, accepted. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c00339.

6. S. Su, Z. Y, H. Gao, H. Yang, S. Zhu, Z. An, J. Wang, Q. Li, S. Chandarlapaty, H. Deng, W. Wu*, Y. Rao*, Potent and Preferential Degradation of CDK6 via PROteolysis TArgeting Chimera Degraders. Journal of Medicinal Chemistry, 2019, 62, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b00871.

7. Y. Sun, N. Ding, Y. Song, Z. Yang, W. Liu *, J. Zhu*, Y. Rao*, ‘Degradation of Bruton's tyrosine kinase mutants by PROTACs for potential treatment of ibrutinib-resistant Non-Hodgkin lymphomas’, Leukemia, 2019, 33, DOI: 10.1038/s41375-019-0440-x.

8. X. Sun, J. Wang, X. Yao, W. Zheng, Y. Mao, T. Lan, L. Wang, Y. Sun, X. Zhang, Q. Zhao, J. Zhao, R-P. Xiao, X. Zhang*, G. Ji*, Y. Rao*, ‘A Chemical Approach for Global Protein Knockdown from Mice to Non-human Primates’, Cell Discovery, 2019, DOI: 10.1038/s41421-018-0079-1.

9. Z. An, W. Lv, S. Su, W. Wu*, Y. Rao*, ‘Developing potent PROTACs tools for selective degradation of HDAC6 protein’, Protein & Cell, 2019, DOI: 10.1007/s13238-018-0602-z. Q.

10. Y. Sun, X. Zhao, N. Ding, H. Gao, Y. Wu, Y. Yang, M. Zhao, J. Hwang, Y. Song, W. Liu *, Y. Rao*, ‘PROTAC-Induced BTK Degradation as a Novel Therapy for Mutated BTK C481S Induced Ibrutinib-Resistant B-Cell Malignancies’, Cell Research, 2018, 22, 779–781.