2025年6月6日,清华大学药学院储凌课题组在《Journal of the American Chemical Society》期刊发表了题为“Silicon-Rhodamine-Catalyzed Near-Infrared Light-Induced Photodecaging of Ortho-Nitrobenzyl Groups In Vitro and In Vivo”的研究论文。本研究开发了一种由硅罗丹明(SiR)作为光氧化还原催化剂,在近红外光(660 nm)触发下实现ONB的高效光脱笼的方法,该方法可以在体外及体内实现ONB的光脱笼,为利用近红外光实现生物系统的时空调控提供了新的工具。

研究背景
光作为一种外部刺激源,能以极高的时空精度调控生物过程。光脱笼(即通过光照解离保护基团以释放被保护的生物活性分子)是调控小分子(如药物、神经递质、激素)和大分子(如蛋白质、寡核苷酸)的常用策略。从19世纪60年代被发现光脱笼功能以来,邻硝基苄基(ONB)基团凭借其分子尺寸小和光脱笼效率高的优势,已成为应用最广泛的光笼基团。然而,ONB的高效光裂解通常依赖于紫外或蓝光,这类光不仅对生物体系具有光毒性,组织穿透能力也有限。相比之下,近红外(NIR)光具有更深的组织穿透性、更高的空间精度及更低的光损伤风险,因此开发基于NIR的光脱笼技术具有显著优势。
尽管近年来多种响应近红外光的光笼基团/分子已被开发,但其复杂的合成路线、大分子量导致的溶解性差等问题限制了实际应用。双光子脱笼策略虽能利用近红外光激发,但ONB基团的双光子敏感性较低,且依赖昂贵的专用设备。上转换纳米粒子(UCNPs)介导的光活化方案则受限于纳米颗粒的细胞渗透性差、上转换效率不高,以及980 nm激发光与水分子吸收峰重合引发的组织热效应。因此,开发一种通用性强、操作简便(使用易得设备和试剂)的ONB近红外光脱笼新方法显得尤为迫切。
研究内容
清华大学储凌课题组开发了一种创新策略:利用硅罗丹明(SiR)作为光氧化还原催化剂,在近红外光(660 nm)触发下实现ONB的高效光脱笼。该反应在多种底物上均取得高产率,涵盖氨基酸、核苷酸、前药、生物活性小分子、荧光染料和蛋白质等。机理研究表明,脱笼过程通过单电子转移(SET)机制引发硝基还原,随后发生电子级联触发的自消除反应。该技术成功应用于哺乳动物细胞和细菌体系。更重要的是,团队进一步开发了针对非内化性癌细胞表面标志物的抗体-药物偶联物(ADC)的NIR光控前药释放方案,并在荷瘤小鼠模型中验证了其体内应用的有效性。
图1. 近红外光介导的ONB脱笼策略
首先,经过对催化剂和反应条件的系统筛选,确定含羧酸基团的 SiR-2 为最优催化剂。在无氧条件下,以还原剂 NADH 作为电子供体,该催化体系能在水环境中高效实现多种底物的光脱笼(表1)。该催化体系成功应用于包括氨基酸、核苷酸、荧光探针、抗癌和抗菌药物及生物大分子在内的数十种底物,均展现出优异的适用性。例如:半胱氨酸与脱氧寡核苷酸的脱笼产率达 85–99%,为基因调控工具开发提供了新途径。抗癌前药单甲基澳瑞他汀 E (MMAE) 和喜树碱 (CPT) 的释放效率 >90%,凸显其在精准化疗中的应用潜力。值得注意的是,传统上对紫外光敏感的叠氮苯和二苯甲酮基团,在 NIR 光照下也分别实现了 99% 和 82% 的高效脱笼,有效规避了紫外光源可能引发的副反应风险。这些结果充分证明了该技术在近红外光控释放多种生物活性分子(从小分子前药到生物大分子)方面具有广泛的适用性和高效性。
表1. 近红外光介导的 ONB 脱笼反应的底物范围
为验证在蛋白水平上的脱笼效果,该研究将末端含有ONB基团的Halo配体与Halo蛋共价结合,获得蛋白模型复合Halo-HTL-NO₂(图 2A)。高分辨质谱分析显示,经NIR光照30分钟后,复合物对应的分子离子峰质量数降低了133.5 Da,强有力地证实ONB光笼基团被成功脱除,从而释放出Halo与其配体HTL的复合物(Halo-HTL)(图 2B)。这一光控的Halo标签系统为活细胞内蛋白质功能的原位、时空高精度调控提供了有力工具,有望推动蛋白质动态行为的深组织层面研究。
图 2. 近红外光介导的笼状Halo-Tag蛋白的光脱笼
为阐明光催化脱笼反应的机理,研究者开展了系统的实验验证。对照实验证实,光催化脱笼反应需同时依赖光照、催化剂SiR-2和还原剂NADH(图3A,B)。自由基捕获实验显示,加入淬灭剂TEMPO可完全抑制反应(图3B),暗示自由基中间体的参与。电子转移路径研究发现:无底物时,蓝色反应液光照10分钟后褪色,停止光照后缓慢复蓝;而无 NADH 时无此现象(图3C)。吸收光谱验证该颜色变化源于,激发态SiR-2* 被NADH还原为无色自由基(PC·⁻)。进一步通过电子顺磁共振(EPR)和质谱分析直接检测到自由基信号,HRMS鉴定出了NADH-DMPO与SiR2-DMPO加合物的生成,证实了自由基的生成。此外,还对催化剂的进行了电化学检测(图3D)。基于这些证据,研究者提出了图 3E 所示的机制途径。该过程始于SiR-2在光照下被光活化,生成激发态(SiR-2*),随后被 NADH 还原。还原的催化剂通过单电子转移(SET)向 ONB 底物转移一个电子并返回基态。ONB 基团接收电子后被还原为羟胺并发生自降解,最终生成目标产物。
图 3. 光催化脱笼机理研究
在活细胞水平的功能验证进一步彰显了该技术的实用性。如图4所示,在缺氧培养的人骨肉瘤细胞(U2OS)中,被ONB基团淬灭的荧光探针MeRho-NO₂经SiR-2催化后荧光信号增强(图4C),流式细胞术定量显示脱笼效率达46%(图4D)。在抗菌实验中,将抗菌药甲氧苄啶(TMP)设计为前药TMP-NO₂,通过在大肠杆菌培养体系使用NIR光照,用于催化药物脱笼释放(图4E)。实验结果显示:仅当同时存在催化剂SiR-2、还原剂NADH及660 nm光照时,细菌存活率显著下降,而前药本身几乎无毒性,充分验证了光控抗菌策略的可行性(图4F)。
图4. 在活细胞中验证近红外光催化荧光探针和抗菌药物的脱笼
针对传统抗体偶联药物(ADC)依赖癌细胞抗原内吞才能释放毒素的局限,该研究构建了靶向PD-L1抗体(Avelumab)的非内化型ADC(MMAE-NBC-Amab)。该设计利用ONB衍生的NBC连接子桥接抗体与抗癌毒素MMAE,使其仅在NIR光照下脱笼并恢复药物活性。在4T1乳腺癌细胞模型中,缺氧环境下使用NIR光照,结果显示ADC治疗组细胞存活率显著降低,而黑暗对照组则无显著毒性。此外,在4T1荷瘤小鼠活体实验中,瘤内注射ADC、SiR-2与NADH,辅以单次10分钟660 nm激光照射(0.5 W/cm²),仅四次治疗即实现肿瘤体积增长的显著抑制,且所有治疗组小鼠均无体重下降或死亡。
图5. 近红外光介导的抗体药物偶联物体内和体外光脱笼
总之,本研究开发了一种基于硅罗丹明(SiR)作为光氧化还原催化剂、通过近红外光(NIR)触发oNB基团脱笼的新型方法。该反应在低氧条件下利用外源NADH作为添加剂高效进行,具有极低的细胞毒性及广泛的底物兼容性。我们证明该反应可在细胞培养基及细胞表面进行。我们预期该方案可被广泛应用于体外及体内研究,为利用近红外光实现生物系统的时空调控提供了可能。
致谢
清华大学药学院储凌副教授、深圳市第二人民医院的黄卫人研究员为本文的共同通讯作者,博士后闫潇洒为本文的第一作者,清华大学药学院的杜娟娟老师、清华大学化学系的郭兴伟老师、焦雷老师、上海交通大学化学化工学院的陈刚老师及中国科学院化学研究所的程靓老师为本文提供了重要的实验支持。
论文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c04942